Zur Untersuchung oder zu anderen Zwecken werden oft Proteine in reiner Form und in gewissen Mengen benötigt. Diese Proteine, mit bekannter oder unbekannter Funktion, werden meistens auf Basis ihrer cDNA in Säugerzellen oder E. coli hergestellt. Diese Proteine werden sodann gereinigt und können anschließend für verschiedene Unterschungen benutzt werden.
Die Herstellung eines rekombinanten Proteins in E. coli bietet sich an, wenn große Mengen eines Proteins, z. B. zur Immunisierung, benötigt werden. Durch die Einführung eines “Affinitätstags” über den Expressionsvektor lassen sich die Fusionsproteine in der Regel auch einfach aus dem Bakterienlysat reinigen. Die Verwendung modifizierter Wirtsstämme erlaubt u. U. auch in E. coli die korrekte Phosphorylierung des Proteins. Die Expression eines Gens in Säugerzellen bietet gegenüber der Expression in E. coli den Vorteil, dass die korrekten posttranslationalen Modifikationen an dem Genprodukt erfolgen können. Durch Einführung eines “Affinitätstags” kann man zwischen dem rekombinanten und dem eventuell vorhandenen endogenen Protein unterscheiden. Je nach Untersuchungsziel wird man sich für transiente oder stabile Transfektion der Säugerzelle entscheiden und geeignte Vektoren verwenden.
Im Verlauf des Kurses werden verschiedene Vektoren und Zell-Systeme besprochen, die zur Herstellung von rekombinanten oder nativen Proteinen in E. coli, in Säugerzellen und im Baculo-Virus-System benutzt werden können. Dabei werden sowohl die Vorteile und Nachteile wie auch vernünftige Anwendungen der verschiedenen Systeme besprochen und diskutiert.
Im Praxisteil des Kurses werden Lysate aus Bakterien, die ein Fusionsprotein mit einem Histidinhexamer herstellen, untersucht. Danach wird das Fusionsprotein durch Ni2+-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Untersuchung der Lysate und des gereinigten Proteins erfolgt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot.
